MOŽNOSTI DIAGNOSTIKE GLIV IZ RODU Verticillium spp. Z METODO AFLP
(DOLŽINSKI POLIMORFIZEM NAMNOŽENIH FRAGMENTOV)

  Sebastjan RADIŠEK¹, J. JAKŠE ², Branka JAVORNIK<sup>3  

1</sup> Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Žalec, SI-3310 Žalec, Slovenija  
^2,3 Center za rastlinsko biotehnologijo in žlahtnjenje, Biotehniška fakulteta, SI-1000 Ljubljana, Slovenija

AFLP je novejša molekularna tehnika s široko uporabno vrednostjo pri različnih organizmih, saj nam omogoča detekcijo velikega števila DNA polimorfizmov v posamezni analizi, ima visoko ponovljivost in je lahko primerna za rutinske analize. Temelji na selektivni PCR amplifikaciji restrikcijski fragmentov, ki so produkt razreza genomske DNA z restrikcijskimi endonukleazami. Razlike med organizmi lahko odkrivamo brez predhodnega znanja o sekvencah genoma proučevanega organizma saj so le te odvisne od sprememb prepoznavnih mest restrikcijskih encimov, ki nastanejo zaradi mutacij. Metoda zajame celoten genom in je primerna za ločevanje ozko sorodnih organizmov znotraj vrste. Metodo AFLP smo uporabili za ugotavljanje DNA polimorfizma med izolati gliv Verticillium alboatrum Reinke & Berthold in Verticillium dahliae Klebahn, ki povzročata hmeljevo uvelost. Izolate gliv smo inokulirali v tekoče gojišče in jih štiri dni gojili na tresalniku. Micelij smo nato sprali z bidestilirano vodo in zbrali s centrifugiranjem. DNA iz micelija smo izolirali po metodi SDS. V analizi smo uporabili 500ng DNA, ki smo jo razrezali z endonukleazama EcoR I in Msp I. Po končani restrikciji smo dodali encimsko-specifične adapterje, ki smo jih z ligacijo vezali na restrikcijske fragmente. Ti so služili kot tarčno mesto za začetne oligonukleotide z dvema selektivnima bazama s katerimi smo v PCR reakciji namnožili omenjene fragmente. Detekcijo namnoženih produktov smo opravili s 5% denaturacijsko poliakrilamidno elektroforezo in detektirali s srebrom. V analizi smo ugotovili razlike med obema vrstama iz rodu Verticillium, v nadaljevanju pa nameravamo s preizkušanjem različnih kombinacij začetnih oligonukleotidov ovrednotili razlike med izolati znotraj posamezne vrste.

ABSTRACT

  DIAGNOSIS OF FUNGI OF THE Verticillium spp. GENUS WITH THE AFLP  
(AMPLIFIED FRAGMENT LENGHT POLYMORPHISM) METHOD

AFLP is novel molecular technique with wide application in many different organisms, mainly due to the ability to detect a very high number of polymorphisms in a single assay, good repeatability and possibilities of automatisation. It is based on the selective PCR amplification of restriction fragments from total digestion of genomic DNA. It enables detection of genetic variations between closely related organisms. We used this technique to detect DNA polymorphism between isolates of the plant pathogenic fungi Verticillium alboatrum Reinke & Berthold and Verticillium dahliae Klebahn., which causes hop wilt. In order to extract genomic DNA, we inoculated liquid media and incubated on orbit shakers for four days. Mycelium was collected by centrifugation and washed with demineralised water. DNA was extracted by the SDS method and digested with two enzymes, EcoR I and Msp I. The digestion adapters were then ligated to restriction fragments. The adapter-ligated fragments were amplified in PCR reaction by primers with two selective bases. The amplified fragments were separated by 5% denaturating polyacrylamid gels and visualised by silver staining. We detected DNA polymorphism between species of the genus Verticillium. In further research, we will test more primer combinations to assess genetic variations among isolates.