Uporaba tkivnih kultur za izboljšanje detekcije fitoplazem v vinski trti

   
Nataša PETROVIČ, Nataša JERAJ, Maja RAVNIKAR

Nacionalni inštitut za biologijo, Oddelek za rastlinsko fiziologijo in biotehnologijo, SI-1000 Ljubljana, Slovenija

Za ugotavljanje zastopanosti fitoplazem, ki povzročajo bolezni trsnih rumenic na vinski trti je opisanih že kar nekaj občutljivih, specifičnih in zanesljivih laboratorijskih metod. Še vedno pa pri vseh metodah predstavljajo težave: neenakomerna razporejenost, nizka vsebnost in sezonska nihanja v vsebnosti fitoplazem v trsih. Le-ti so glavne ovire pri uvajanju in standardizaciji protokolov za rutinsko uporabo molekularno-bioloških in seroloških hitrih laboratorijskih detekcijskih metod za potrebe potrjevanja in karantenskega nadzora.

Naše prejšnje izkušnje in nekatere navedbe iz literature kažejo, da rastline v tkivni kulturi lahko vsebujejo večjo koncentracijo patogenov (virusov) kot rastline, ki rasejo v zemlji. Virusi so v in vitro rastočih rastlinah tudi po vseh organih enakomerno razporejeni. Na osnovi teh izkušenj in poročil smo domnevali, da se tudi koncentracija in enakomernejša razporeditev fitoplazem lahko pojavi  kadar okužene rastline Vitis vinifera in Catharanthus roseus gojimo v tkivni kulturi.

Rezultati so pokazali, da je koncentracija fitoplazem v vinski trti in v C. roseus, gojenih v tkivni kulturi, mnogo večja kot pri istih rastlinah raslih v zemlji.  Fitoplazme so v rastlinah v tkivni kulturi zastopane tako v poganjkih kakor tudi v koreninah, kjer je njihova koncentracija včasih celo večja kot v poganjkih. Rezultati so pokazali, da je koncentracija fitoplazem v vinski trti v tkivni kulturi mnogo nižja kot v C. roseus, zato je za detekcijo fitoplazem v vinski trti še vedno nujno potreben postopek, kjer uporabimo tudi nested PCR tehniko.

Treba je poudariti, da je koncentracija fitoplazem v rastlinah ocenjena le glede na količino PCR produktov, ki jih dobimo pri postopku PCR v enakih razmerah. Razlike v tako ocenjeni vsebnosti fitoplazem v različnih rastlinah, tkivih ali v različnih razmerah rasti niso nujna posledica dejanskih razlik v vsebnosti fitoplazem, temveč so lahko tudi posledica različno močnih inhibitornih učinkov (na primer različne vsebnosti inhibitorjev PCR reakcije, kot so ogljikovi hidrati in fenoli).

Rezultati nakazujejo možnost uporabe tkivnih kultur kot alternativne metode za izboljšanje razmer za ugotavljanje zastopanosti fitoplazem v vinski trti, posebej, kadar gre za izredno nizko vsebnost fitoplazem v specifičnih vzorcih ter pri odkrivanju morebitnih latentnih okužb. Kažejo tudi na nove možnosti pri študiju interakcij med rastlinami in fitoplazmami, gibanja fitoplazem po rastlini, čiščenja fitoplazem za pripravo protiteles in za ohranjanje določenih fitoplazemskih sevov in mutant.

ABSTRACT

The use of tissue culture for improved detection of phytoplasma in grapevines

During the past few years, several sensitive, specific and reliable laboratory methods have been described for detection of grapevine yellows phytoplasma. However, non-homogenous distribution, low concentration and seasonal variations of grapevine yellows phytoplasma in grapevines remain as main problems which prevent the introduction and standardization of molecular biology- and serology - based quick laboratory detection protocols for their routine use in certification and quarantine.

Our previous experiences and other reports show that plants grown in tissue culture contain much higher concentrations of viruses than plants grown in soil. Moreover, viruses seem to be relatively homogeneously distributed in all organs of in vitro grown plants. Based on these experiences and reports we wanted to test a possibility of increasing phytoplasma concentration and homogenous distribution in phytoplasma infected Vitis vinifera and Catharanthus roseus by growing them in tissue culture.

The results indicate the increase of the phytoplasma levels in grapevine and periwinkle plants grown in tissue culture in comparison with the plants grown in soil. Phytoplasma in tissue culture plantlets are present in shoots as well as in roots, and that their concentration in roots is possibly even higher than in shoots. The results also showed that the level of phytoplasma in grapevines is much lower than in  periwinkle, and that the use of a nested PCR is essential to increase the sensitivity to a level suitable to detect phytoplasma in grapevines. However, the differences in PCR results in different plants, tissue, or factors influenced by the growing conditions may not necessarily represent the differences in actual phytoplasma concentration, but could be a consequence of different levels of inhibitory effects (e.g. differences in levels of inhibitors of PCR, such as carbohydrates and phenolics).

Present results indicate the potential use of tissue culture as an alternative tool in improving laboratory methods of phytoplasma detection in grapevines, especially in detecting extremely low concentrations of phytoplasma in specific samples of grapevine, in discovering latent infections, and as a further application in studies of host/pathogen interactions, movement in plants, purification of grapevine yellows phytoplasma for antibody production, and for maintenance of specific phytoplasma strains and mutants.